GPB︱本实验室团队开发单细胞m6A修饰定量新方法

2024年6月7日，Genomics, Proteomics & Bioinformatics （GPB）上发表了本团队安三奇教授等“Scm6A: A fast and low-cost method for quantifying m6A modifications at the single-cell level”的研究论文，该研究成功开发了一种名为Single-cell m6A Analysis（Scm6A）的新型计算方法，文章第一作者在读博士生李玥琪将在此详细介绍该方法。该方法主要利用机器学习技术，能够快速且低成本地预测单个细胞中的m6A修饰水平，利用普通单细胞转录组数据对单细胞水平上对N6-甲基腺苷(m6A)修饰的定量分析领域取得了新的进展。

背景介绍

m6A是信使RNA（mRNA）中最普遍的表观遗传修饰之一，在基因表达调控中扮演着关键角色，并与多种疾病的生理过程紧密相关。目前的研究普遍认为m6A在不同细胞间存在显著的特异性，然而传统的定量方法难以在单细胞水平上对其进行精确检测，因此，迫切需要研发一种高效、准确的单细胞水平m6A定量分析方法。

主要结果

基于RBP-m6A共表达网络构建Scm6A预测模型

本文基于安三奇等人先前研究，利用现有的593个m6A调控因子与m6A的对应关系，构建了多种机器学习模型，经模型性能评估得出随机森林模型的效果最优。RF模型在测试中的中位平衡准确率为0.91，显著高于其他模型。进一步的比较分析发现，结合顺式和反式调控元件的RF模型表现最好。随机化重新标记样本的实验也验证了RF模型的高准确性。最终，研究确定了最佳的单细胞m6A计算方法，并将其命名为Scm6A。

Scm6A的准确性和可靠性通过人PBMCs MASC的m6A-seq进一步验证

本研究对四名健康参与者的外周血单核细胞（PBMCs）进行scRNA-seq分析，使用Scm6A计算CD4+和CD8+ T细胞的单细胞m6A水平。同时，使用改进的winscore方法进行m6A-seq分析。通过比较同一基因区域内精确匹配的m6A窗口，验证了Scm6A预测的m6A水平与m6A-seq测量结果之间的显著相关性（R=0.41,P=7.4x10-4）。随机化的m6A位点分析显示，相关性几乎不存在（R = 0.0051, P = 0.97），确认了Scm6A的预测结果非随机。总体而言，Scm6A是一种高效、可靠且具成本效益的单细胞m6A分析工具，为研究细胞表观遗传特性提供了有力支持。

通过m6A-seq鉴定m6A在CD4+ 和CD8+ T细胞中的潜在作用和前景

研究通过结合m6A-seq和scRNA-seq分析，揭示了m6A在CD4+ 和CD8+ T细胞中的不同作用和调控模式。研究发现CD4+ T细胞的m6A峰值倾向于富集在终止密码子附近，而CD8+ T细胞的m6A峰值则主要出现在编码区和起始密码子，提示了可能存在不同的m6A调控因子。此外，GGACU基序在CD4+ T细胞中的m6A峰值富集特别显著。通过Scm6A和scRNA-seq的联合分析，研究者进一步确认了m6A在T细胞分化中的关键作用，并证实了Scm6A作为单细胞m6A分析的可靠性和有效性。

通过Scm6A鉴定m6A在CD4+和CD8+ T细胞中的潜在作用和前景

研究探索了Scm6A与scRNA-seq结合分析的效果，并与MACS分离细胞后的m6A-seq和RNA-seq结合分析进行了比较。结果显示，Scm6A计算出的m6A峰值在CD4+ T细胞中倾向于富集GGACU基序，与m6A-seq分析结果一致。通过无监督聚类分析，我们在单细胞水平上对CD4+ 和CD8+ T细胞的m6A进行了全面分析，并观察到两种不同的单细胞m6A景象，它们根据细胞类型被清晰地区分开来。此外，我们还预测了单个样本中CD4+ 和CD8+ T细胞的m6A水平，并使用聚类热图展示了相同细胞类型内部的相似性和不同细胞类型群之间的异质性。这些含有m6A修饰的基因在T细胞分化和细胞分化中富集，并且m6A沉积基因的表达水平与差异甲基化位点的m6A水平呈正相关。这些结果与MACS分离细胞的m6A-seq分析结果一致，进一步证实了Scm6A作为单细胞水平m6A分析方法的可靠性。

Scm6A在COVID-19和肺癌细胞亚型中的应用揭示了m6A在耗竭的CD8+ T细胞中的潜在作用和调节因子

研究还使用Scm6A方法深入研究了耗竭型CD8+ T细胞（CD8_EM）在不同肺癌类型中的m6A景观，包括鳞状细胞肺癌（LUSC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。发现耗竭型CD8+ T细胞的m6A特征与其他T细胞亚群存在差异，并且这些细胞的m6A修饰水平与IL-7信号通路密切相关，而IL-7信号通路与T细胞稳态相关。研究揭示了19种m6A调控因子（包括METTL3、METTL14和HMGB1）与CD8_EM相关m6A水平显著正相关，表明这些调控因子可能通过靶向IL-7来调节T细胞稳态。

总结与展望

Scm6A方法通过分析m6A调控因子的表达水平和顺式序列特征，构建了一个高效的预测模型。研究团队通过与改进的基于winscore的m6A-seq（N6-甲基腺苷测序）分析进行比较，验证了Scm6A的准确性和可靠性。此外，研究人员还将Scm6A应用于不同肺癌亚型的单细胞水平m6A分析，并揭示了m6A在耗竭性CD8+ T细胞中的潜在作用和调节因子。这项工作不仅为单细胞m6A检测提供了一种新颖、可靠和准确的工具，而且有望在m6A相关研究领域得到广泛应用。安教授表示：“我们相信Scm6A将为研究者提供一个快速有效的手段，以探索细胞的表观遗传特征，并有望在多种生物学过程中对单细胞m6A的作用有更深入的理解。”